طراحی و ایجاد موتاسیون در ژن wbk a بروسلا آبورتوس s19 به روش overlap extension pcr

زمینه مطالعه: ایجاد موتاسیون در جایگاه اختصاصی می تواند یکی از روش های کارآمد جهت بررسی ویژگی و خواص تنظیمی ژن های گوناگون باشد. ﺑﺮوﺳﻠﻮز از ﻣﻬﻢ ﺗﺮﯾﻦ ﺑﯿﻤﺎریهای ﻋﻔﻮﻧﯽ ﻣﺸﺘﺮک ﺑﯿﻦ اﻧﺴﺎن و دام اﺳﺖ ﻛﻪ ﻣﻨﺠﺮ ﺑﻪ بروز ﺿﺮرهای اﻗﺘﺼﺎدی ﻓﺮاواﻧﻰ ﻣﻰ ﺷﻮد. ﺑﻨﺎﺑﺮاﯾﻦ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﻋﻮاﻣﻞ پاتوژن و اﯾﻤﻨﯽ زا در جنس ﺑﺮوﺳﻼ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان راهگشای ﺟﻬﺖ ﮐﻨﺘﺮل اﯾﻦ ﻣﻌﻀﻞ ﺑﻬﺪاﺷﺘﯽ ﻣﻄﺮح ﻣﯽ ﺑﺎﺷﺪ. هدف: با توجه به اهمیت جهش هدفدار در شناسایی ساختار ژنوم و وجود روش های متعدد جهت دست یابی به این هدف، روش overlap extension pcr به عنوان یک تکنیک اصلاح شده جهت حذف و جایگزینی ژن هدف معرفی می شود. روش کار: جهت انجام این تحقیق، با انجام دو مرحله pcr با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، قطعات بالادست و پایین دست ژن هدف از ژنوم باکتری و کاست مقاومت آنتی بیوتیکی از پلاسمیدa(+)رpet28، تکثیر یافته و به یکدیگر اتصال یافتند. قطعه حاصله با استفاده از آنزیم های محدودالاثر که توالی آنها در انتهای ´5 پرایمرهای خارجی قرار داده شده است، در جایگاه اختصاصی از پلاسمید (-) pbluescriptiiskهمسانه سازی شده و پس از حصول اطمینان از عدم ایجاد جهش خودبخودی در حین مراحل pcr، با استفاده از روش الکتروپوریشن به داخل ژنوم بروسلا آبورتوس انتقال یافت. نتایج: همسانه سازی محصول pcr اتصالی که بدون بروز تغییر در توالی نوکلئوتیدی حاصل شده بود، داخل پلاسمید (-) pbluescriptiisk انجام شد و پس از انتقال الکتریکی پلاسمید به ژنوم بروسلا آبورتوس، طی عمل ریکامبینیشن باعث جهش در ژن مورد نظر گردید. نتیجه گیری نهایی: نتایج این مطالعه نشان می دهد که overlap extension pcr یک تکنیک بهینه و اصلاح شده به منظور ایجاد جهش در ساختار ژنوم باکتری بوده و به راحتی می تواند در خانواده بروسلا استفاده گردد.